За историята на манастира през времето на османското нашествие и след падането на Второто българско царство няма много сведения. Сградата и църквата не са били разрушени, нито дори кулата. Предполага се, че поради непристъпното му разположение, от една страна, а от друга, поради липсата на стратегическо значение, не е била предприета трудна обсада и разрушаване. В старинен ръкопис пише, че манастирските имоти били отнети и манастирът изпаднал в голяма нищета. Допуска се, че са останали само няколко монаси, препитаващи са от подаяния, да го поддържат, през XVI и XVII век.[2]:с. 39 – 40
След това настъпва подем. Чрез дарения манастирът отново се сдобива със земи, монасите се увеличават и манастирът става духовно средище за околните каази – златишката, ловчанската и дори плевенската, притегателен център за богомолците, недоволни от гръцкото духовенство и желаещи словото на български език. В края на XVIII и началото на XIX век манастирът има широки връзки из цяла България и дори в Румъния и Русия, както личи от неговите кондики. Запазени са два стари печата от тези времена, в които се нарича киевски манастир. Знае се, че е притежавал много ръкописни и старопечатни книги.[2]:с. 45 – 47
Манастирът открива редица килийни училища. Предполага се, че училището в самия манастир е съществувало още от основаването му и е продължило да подготвя послушници за монаси, свещеници и учители с малки прекъсвания до Освобождението; учители са били самите монаси, за учебници са използвали църковни книги. В близкото село Малък извор открива метох с килийно училище. В Ловеч Гложенският манастир също открива свой метох, а към него – първото килийно училище в града (през чумавата 1828 г. вече го е имало), което след това превръща във взаимно и смесено училище. За него ангажира най-добрите учители и учителки в този край: даскал Павлин (сърбин), Христо П. Попович, даскал Коста, даскал Русчо, поп Лукан, Парашкева Нейкова, учила момчета и момичета, а после само момичета, и други. Троянският и Рилският манастир също откриват метоси в Ловеч, но без училища, само с по един духовник изповедник.[2]:с. 51 – 53, 61
Гложенският манастир изпраща да следват в Русия и трима свои послушници – Лило Кънчев от село Гложене (по-късно митрополит Антим Търновски), Димитър Секов от с. Малък Извор (йеромонах Дионисий Симеонов, учителствал 14 години в селата Малък и Голям извор, а от 1894 г. игумен на манастира) и Михо Динов от Гложене (с монашеско име Евтимий, учител в Браила и на други места, дякон на екзарх Йосиф, свещеник, игумен на „Св. Илия“ в Тетевен и на Гложенския манастир 1911 – 1914 г.).[2]:с. 55
Средствата за тази дейност манастирът намира от дарения от цялата страна (по времето на игумена лечител хаджи Евтимий голямо дарение прави дори турчин), добро стопанисване на обширните земи, гори, воденици и пр. и силната подкрепа от местното население. Когато през 1856 или 1857 г. пожар унищожава голяма част от килиите, манастирът прави дълг, които бързо бива изплатен чрез доброволните, охотно давани помощи от населението на ловчанската и златишката кааза.[2]:с. 47 – 49, 56 От по-стари времена са запазени няколко поменика с имена на поклонници дарители от XVIII – XIX век. В тях се срещат имена от села от Тетевенско и Луковитско, които днес са помашки.
Владиците и монасите от Гложенския манастир са поборници за независима българска църква. Игуменът Йоаникий (около 1840 – 1864) не допуска никаква намеса на гърците в манастирските работи и дава много средства за манастирските училища, където се създават настроения против гърцизма. Следващият игумен, хаджи Евтимий, действа пряко като представител на Българска екзархия още преди признаването ѝ.[2]
По време на националноосвободителните борби манастирът е една от най-сигурните бази на Васил Левски. Широките връзки на хаджи Евтимий, негов близък приятел, из района и сведенията му за надеждните хора спомагат за основаването на комитети по селата. Самият игумен и калугерът поп Кирил са членове на гложенския частен революционен комитет, както и поп Михаил Стефанов и поп Никола Цаков. В този район се създава и първият революционен окръг. Запазено е скривалището на Васил Левски – под килията му е имало подземен тунел, прокопан още при изграждането на манастира. Посещенията на Левски са пазени в най-дълбока тайна (включително и заради гръцкия монах Иларион и манастирската прислуга), Димитър Общи не е бил посветен и затова предателството му не засяга пряко манастира.